dsh-molbio-tools

面向 DeepSeek Harness 的零依赖分子生物学研究插件：序列分析、引物自动设计与检查、限制性酶切模拟、GenBank 解析与质粒图谱、qPCR 分析、文献助手与实验台计算。除文献检索与存储外全部为确定性纯计算；插件由纯 .mjs 文件构成，可随 agent preset 目录整体复制分发。

提供的工具（46 个，模型可调用）

序列分析

工具	功能
molbio_reverse_complement	反向互补 / 互补链（IUPAC 简并码，自动忽略空白与数字）
molbio_gc_content	整体 GC 含量 + 可选分窗口 GC 百分比
molbio_translate	1/2/3/-1/-2/-3 或六框翻译（3 套密码子表），ORF 查找
molbio_restriction_sites	内置 90+ 限制酶（v10 起含 IIS 型：BsaI/BsmBI/BbsI/BspQI/SapI/PaqCI/AarI/BtgZI/BsmFI/FokI 等，切点在识别位点外，显示标准 (N₁/N₂) 记法）位点搜索与酶切片段计算（线性/环状）
molbio_enzyme_lookup	v13 酶目录查询：按名称/识别位点/切点几何/突出端长度查 90+ 酶表；给定序列时报告双链向全部切点（IIS 酶的反向识别位点如 GAGACC 也会被切，这是 molbio_restriction_sites 不报告的）与片段大小

引物

工具	功能
molbio_design_primers	自动设计 PCR 引物对：Tm（SantaLucia 1998 NN，默认 50 mM Na⁺/1.5 mM Mg²⁺/200 nM，v13 起可用 na_mm/mg_mm/dntp_mm/primer_nm 调节）、GC、GC clamp（0-3 分级）、run/发夹/自互补/二聚体约束，按 amplicon 窗口配对并排序。v12 起结构筛查对齐 Primer3 模型：自互补为比对分（match +1/mismatch −1/gap −0.25，阈值 8.0/3.0），发夹与引物二聚体用同一套 NN 参数折成 Tm（默认 47 °C 阈值），3' 端稳定性（末 5 碱基 ΔG(37°C) ≤ 9 kcal/mol）与末 5 碱基 GC 数。v12 起支持错配容差：max_mismatches > 0 时允许引物与模板有少量错配（3' 末端碱基绝不错配、默认避开 3' 端关键区），每处错配在 mismatches 中报告并计入排序罚分，精确引物总是优先。check_mispriming: true 检查 3' 尾在模板上的非特异结合位点并拒绝/罚分。v13 起支持 3' 目标位置偏好：target_position + target_penalty 按"较近引物 3' 端到目标位点的距离"罚分排序（SNP/定点设计用），每对报告 target_distance
molbio_design_intron_primers	跨内含子 qPCR 引物（v10）：给定基因组序列 + 外显子坐标，正向引物跨外显子-外显子连接点（两侧各 ≥ min_junction_bases），反向引物位于另一外显子，基因组 DNA 无法扩增；min_genomic_span 强制最小基因组间距；输出剪接坐标 + 基因组坐标双套位置。v12 起支持错配容差（参数同 molbio_design_primers，错配在 spliced/genomic 双坐标下报告）。v13 起同样支持盐/浓度旋钮与 target_position（剪接坐标）
molbio_primer_tm	单条引物 Tm 估算（Na⁺/Mg²⁺/dNTP 盐校正，von Ahsen 2001）
molbio_primer_check	引物结构筛查：重复序列、自互补（3' 端加权）、发夹、引物对二聚体；v12 起增加 Primer3 同款热力学指标（self-any/self-end 比对分、发夹 Tm、二聚体 Tm、3' 端稳定性/GC）

质粒

工具	功能
molbio_parse_snapgene	SnapGene .dna 文件解析（研究者最常用的格式）：图谱名称、拓扑（环状/线形）、注释特征（类型/区段/链向/标签，支持多段 join 与 HTML 文本清洗）、序列、描述、accession、已保存引物
molbio_plasmid_map_file	一步成图：直接读 .dna（SnapGene）或 .gb/.gbk（GenBank）文件，把 SVG 图谱写入工作区文件并返回 svg_path（默认 .svg，可用 output_path 指定）；写入后自动用系统默认应用打开（auto_view，默认开启）
molbio_parse_genbank	GenBank flatfile 文本解析（complement/join 定位、/gene、/product 等）
molbio_plasmid_map	从序列 + 特征数组渲染并直接写入 SVG 文件（环形默认/线形可选）：特征分道、链向箭头、酶切标记、bp 刻度；同样返回 svg_path 并自动打开

克隆构建

工具	功能
molbio_unique_cutters	克隆选酶：载体单切 + 插入零切的"理想酶"列表（可限定 MCS 区间）、区间双切酶（片段切出）、排除切插入的酶
molbio_clone_simulate	酶切-连接（1-2 酶，orientation=auto 默认自动反向互补方向写反的插入片段）与 Gibson 组装（自动生成同源臂和 insert-to-order）模拟：输出最终质粒序列、特征坐标平移、连接点序列、验证酶切预测（对比空载体，单酶时含反向连接预测）；save_path 存 FASTA、map_path 一步写出新质粒图谱 SVG（含平移后的特征与验证酶标记）
molbio_golden_gate	v13 Golden Gate 组装：IIS 酶（BsaI 等）多片段组装模拟——自动设计唯一、非回文、非互补的 4 bp 突出端（载体已有盒子则读取、裸载体给 replace_region 则自动加盒子并设计两端突出端）、检查酶不切片段/裸载体、生成带识别位点的订购片段（fragments_to_order）、拼出最终质粒（连接处无酶切位点；载体盒子位点保留在骨架上，下一级组装换另一种 IIS 酶）、特征坐标平移与验证酶切；save_path/map_path 直接出 FASTA/SVG
molbio_clone_primers	扩增引物加尾：酶切位点 + 保护碱基（内置推荐表）或 Gibson 同源臂；自动复检全长 Tm（NN 估算）/GC/二聚体，并警告"酶也切模板内部"
molbio_mutagenesis_primers	QuickChange 式定点突变引物：支持 A123G/123A>G/123_125del/after123insGCT，突变居中、G/C 端、Tm/GC/结构复检，报告氨基酸变化（frame 1 假设）

克隆验证

工具	功能
molbio_verify_sanger	读 .ab1（ABIF 二进制：碱基 + 质量值）或 .seq/.txt/.fasta 测序文件 → 与参考质粒比对（环状感知，跨 origin 的读段也能对齐）→ 错配/缺失/插入报告（含质量标注）、同一性、CDS 内氨基酸后果（错义/沉默/移码）

实验与统计

工具	功能
molbio_qpcr_analysis	ΔΔCt 法：各组均值/SD、ΔCt、ΔΔCt、fold change（可设扩增效率）
molbio_qpcr_efficiency	稀释系列 → 标准曲线：斜率/截距/R²、扩增效率 E=10^(−1/slope)−1；plot_path 直接写出带拟合线的 SVG 标准曲线并自动打开
molbio_plot	通用 SVG 图表：柱状图（均值±SD 误差棒）与散点图（可选最小二乘拟合线），写成工作区文件并自动打开
molbio_virtual_gel	v13 虚拟琼脂糖凝胶：各泳道给出预期片段大小（酶切/PCR/连接检查）→ SVG 凝胶图 + 分子量 ladder（1kb/100bp），与真实胶对照；output_path 写工作区文件并自动打开
molbio_lab_math	稀释计算（C₁V₁=C₂V₂）、摩尔浓度、DNA 拷贝数

蛋白质

工具	功能
molbio_protein_props	MW（平均残基质量）、等电点（Bjellqvist 1993 pK）、A280 消光系数（还原/全二硫键两种）、A280(0.1%)、GRAVY（Kyte-Doolittle）、脂肪族指数（Ikai 1980）——均为估算
molbio_peptide_digest	质谱用酶切模拟：trypsin/chymotrypsin/LysC/GluC（P 前不切规则）、漏切 0-3、单同位素/平均 [M+H]+ 质量、质量范围过滤
molbio_codon_optimize	E. coli/酵母/人宿主密码子优化（公开发表的高频密码子表，启发式）；avoid_enzymes 通过同义替换尽量避开指定酶切位点

序列分析扩展

工具	功能
molbio_align	Smith-Waterman 局部比对：可读的比对线（
molbio_fasta_fastq	工作区 FASTA/FASTQ 处理：条目统计（长度/GC）、按 id 提取（可写 FASTA）、FASTQ→FASTA 转换、FASTQ QC（Phred 均值/低质量比例/位点质量分布）
molbio_extract_region	从质粒文件按特征名（如 "AmpR"、"MCS"）或坐标提取子序列，可选反向互补与 FASTA 保存——克隆/设计的下游输入

多序列比对与保守性（v15）

工具	功能
molbio_msa_align	多序列比对（v15）：2-50 条 IUPAC DNA 序列的渐进式比对——两两/谱-谱全局比对用带自由末端缺口的仿射罚分（match +4 / mismatch −4 / 缺口开 −6 / 延伸 −2），合并顺序来自 5-mer 距离 + UPGMA 引导树，"一旦有缺口、永远有缺口"；返回输入顺序的比对序列（sequences 数组或 fasta_path 工作区 FASTA）与两两同一性统计，save_path 直接写出比对后的 FASTA
molbio_conservation	保守性分析（v15）：共识序列（最高频碱基 ≥50% 直接给出，否则给出覆盖碱基的 IUPAC 简并码）、逐列 identity（最高频残基占比，缺口不计）、熵基保守性打分（1 − H/2）、保守/可变列统计（threshold 默认 0.8，可变位点列出至多 200 个；全缺口列计为保守）、两两同一性；输入可给 alignment（已比对等长序列，- 为缺口——如 molbio_msa_align 的输出）、sequences 或 fasta_path（后两者自动先比对）

序列标识图与 CRISPR 设计（v16）

工具	功能
molbio_sequence_logo	序列标识图（sequence logo）：把保守性分析背后的逐列碱基组成画成 SVG——字母高度 = 信息量 Rᵢ = log₂4 − (Hᵢ + e_n)（bits，纵轴 0-2），堆叠高度按碱基频率分配，字母按经典配色（A 绿 / C 蓝 / G 黄 / T 红）。频率只按残基统计（缺口排除并在每列上报），简并碱基按其碱基集合摊分权重（R = A/G 各半）。small_sample（默认开）扣掉小样本熵校正 e_n =(K−1)/(2·ln2·n)——序列数少时这一项很关键（2 条完全相同的序列每列只有 0.918 bits 而不是名义上的 2）；score_type: "frequency" 切换成纯频率图（字母和 = 1，纵轴 0-1）。输入可给 alignment / sequences / fasta_path，写得 SVG 后自动打开；返回 svg_path、总/平均 bits、最保守列、含缺口列数
molbio_grna_design	CRISPR gRNA 设计（默认 SpCas9 NGG PAM）：双链扫描 PAM 锚定的 20 nt protospacer，逐条报告 1-based 顶链坐标、链向、GC%、NN Tm、Primer3 式自互补（self-any/self-end）、种子区自互补、发夹 Tm、最长 poly-T，以及一个逐项公开的启发式评分。硬过滤（GC 上下限、poly-T、3' 自互补、G/C 同聚）可用 gc_min/gc_max/max_t_run/max_self_end 调节，被过滤的条数照常报告。check_off_target（默认开）在同一条序列（双链）上建 k-mer 索引，对得分最高的若干候选做错配容差脱靶搜索（仅替换、无 bulge/indel，PAM 必须完好；种子末端 2 位不允许错配），每个脱靶扣 8 分——想在基因组尺度搜索就把基因组当作 target 传入。save_path 出订购用 CSV，map_path 出带 gRNA 标记的质粒图谱

图谱增强

• molbio_plasmid_map / molbio_plasmid_map_file 新增 gc_skew: true（GC skew 环）与 show_unique_cutters: true（绿色标记所有单切酶）

浏览器内面板（bundle 渠道，可选）

除了工具与"写 SVG 文件 + 系统查看器"这条链路，本包还有浏览器内的右栏面板与图谱调用卡：

落点	内容
Molbio（右栏 tab）	列出当前会话工作区的序列文件，选中当场在面板里画出来——.dna/.gb/.gbk 出质粒图谱 + 特征表，.fa/.fasta 出序列标识图
Papers（右栏 tab）	把 molbio_paper_* 工具维护的 papers.json 渲染成可搜索的阅读列表（标题/作者/期刊/年份/PMID/URL/标签/笔记，标题链接到 PubMed 或原 URL）
图谱调用卡（对话内）	molbio_plasmid_map / molbio_plasmid_map_file 的调用直接在对话里画出这次产出的图谱（摘要 + 写入路径；失败时显示错误文本与 Inspect 入口），不必再去开文件

解析与渲染在浏览器里跑的就是本仓库自己的模块（lib/genbank/snapgene/plasmid/msa/logo 的同一份源码），不落盘、不弹外部窗口。

它走的是 bundle 渠道（dsh.client 双面包），因为 preset 渠道挂不了客户端 UI：

# 只要面板（不把 46 个工具带进该 profile 的每个会话）——推荐给共享的 web profile
dsh plugin --profile 
 add D:\path\to\dsh-molbio-tools\packages\molbio-panel
# 或：工具 + 面板一起（分子生物学专用的 profile）
dsh plugin --profile 
 add D:\path\to\dsh-molbio-tools

装上后重启一次服务并刷新页面（新插件行需要在启动时组合；之后改客户端代码才只靠刷新）， 右栏引导页里会出现 Molbio 与 Papers 两个胶囊。与 preset 渠道可以共存：preset 给 46 个工具，bundle 给面板。

若升级后 GUI 顶栏出现 Failed to load plugins（failed to apply loader entry …），那是某个 客户端 entry 的 apply() 抛了异常，加载器拒绝启动——不是"面板没挂上"。0.7.1 的图谱调用卡 就踩过一次（裸 register() 抢一个还没被声明的座位）；0.7.2 起所有座位都改成 slots.inject 等待声明。升级到 0.7.2+、重启并刷新即可；排查清单见 docs/maintainer.md（"UI 起不来"一节）。

细节（产物格式、服务契约、上限、验证方式、已知限制）见 docs/client-panel.md。

文献助手

工具	功能
molbio_pubmed_search	通过 harness 的 web 检索服务搜文献（自动提取 URL 中的 PMID）
molbio_paper_add	把文献加入阅读库（默认工作区 papers.json，按 PMID→URL→标题+年份去重）
molbio_paper_list	列出阅读库
molbio_paper_update	按 id 更新笔记/标签等字段
molbio_paper_remove	从阅读库删除一条文献

文献与记录

工具	功能
molbio_pubmed_abstract	NCBI E-utilities efetch 按 PMID 拉取摘要（依赖部署提供 web fetch 能力，不支持时明确报错）
molbio_paper_export_bibtex	papers.json → BibTeX .bib 文件（可选按 tag 过滤）
molbio_protocol_add / protocol_list / protocol_update	协议库（protocols.json）：步骤列表、自由参数对象、来源文献 id
molbio_experiment_log / experiment_list	实验日志（experiments.json）：关联协议与文献、笔记与结果

目录结构

dsh-molbio-tools/
├── index.mjs        # 插件入口：export { name, inject, apply }，注册 46 个工具
├── lib.mjs          # 基础库：IUPAC、翻译、酶表（含双链向切点查找）、NN 热力学、qPCR、lab math
├── design.mjs       # 引物自动设计（含跨内含子 qPCR）
├── genbank.mjs      # GenBank flatfile 解析器
├── snapgene.mjs     # SnapGene .dna 二进制解析器（含极简 XML 扫描器）
├── plasmid.mjs      # SVG 质粒图谱渲染器（环形/线形，GC skew/标记）
├── align.mjs        # Smith-Waterman 局部比对 + 锚点窗口（Sanger 验证用）
├── msa.mjs          # 多序列渐进式比对（仿射缺口 NW + UPGMA）与保守性分析
├── logo.mjs         # 序列标识图：逐列碱基组成/信息量 + SVG 渲染
├── crispr.mjs       # CRISPR gRNA 设计：PAM 扫描、质量指标与评分、脱靶搜索
├── cloning.mjs      # 克隆模拟：选酶/酶切连接/Gibson/Golden Gate/克隆引物/突变引物
├── sanger.mjs       # ABIF (.ab1) 解析 + 测序验证报告
├── protein.mjs      # 蛋白性质/肽段酶切/密码子优化
├── plot.mjs         # SVG 柱状/散点图 + 虚拟琼脂糖凝胶渲染
├── seqio.mjs        # FASTA/FASTQ 解析与统计
├── records.mjs      # 协议库/实验日志存储
├── papers.mjs       # 文献库存储（经 harness fs 服务 + 沙箱政策）
├── view.mjs         # 自动查看：把生成的 SVG 交给系统默认应用打开（镜像 host.openPath 语义）
├── build/           # 浏览器半的源码与打包器（见下）
│   ├── client-bundle.mjs # 零依赖打包器：产出 lazy-CJS 客户端产物
│   ├── browser-api.mjs   # 浏览器安全面：从包根 .mjs 再导出面板可用的一切
│   ├── panel-core.mjs    # 面板数据通路（分类/解码/解析/渲染，无 React）
│   └── client-entry.mjs  # 浏览器半本体：右栏 tab 类型 + 正文 + 标题
├── lib/
│   └── client.js    # 客户端产物（exports["./client"]；npm run build:client 生成）
├── cordis.patch.yml # bundle 补丁层（可选安装渠道用，按包名插入 tool-molbio 行）
├── preset/
│   ├── install.mjs  # 渠道 B 安装脚本：把包内 preset 注册为该 profile 的额外扫描根
│   └── molbio-lab/  # 推荐的专属模式预设（agent.cordis.yml + preset.yml + plugins/dsh-molbio-tools-v16/）
├── test/
│   ├── smoke.mjs    # 冒烟测试（复用 harness 自身的 JSON Schema 校验器）
│   ├── slots-stub.mjs # 客户端座位桩：复刻 shell 的 SlotCore 声明规则（见下）
│   └── preset-health.mjs # preset 组合健康检查（逐行按该包自己的 Config schema 校验，对照官方 standard 预设）
├── docs/
│   ├── maintainer.md # 维护者文档（合规对照/开发测试/路线图）
│   ├── client-panel.md # 浏览器内面板的实现记录（产物格式/服务契约/上限/验证）
│   ├── route-b.md   # 安装渠道 B：把包内 preset 注册进 profile（升级 Runbook/取舍/实测）
│   └── client-pipeline-exploration.md # 浏览器内面板的可行性与实现路径调研
├── CHANGELOG.md     # 变更日志（包版本 + preset 版本目录对照）
├── package.json
└── README.md

安装（推荐：专属模式 preset）

推荐给最终用户的方式：安装后预设选择器出现 Molecular Biology Lab 专属模式， molbio 工具只在该模式出现，不会把 46 个工具和提示段注入到其它会话（避免污染无关场景）。

装进对方的 harness 有两条渠道，可以共存：

	渠道 A：复制预设目录	渠道 B：注册包内 preset（新）
做法	把 preset/molbio-lab/ 复制到 ~/.dsh/.agent-presets/molbio-lab/	跑一次 preset/install.mjs，把包内 preset 目录注册为 profile 的额外扫描根
自包含	是（不依赖已装的包，可离线带走）	否（依赖 profile 里已装的包）
升级	每个新版本都要重新复制到新的 vN 目录	`dsh plugin --profile
update dsh-molbio-tools`，不用复制、不用改配置
可否被用户编辑	可以（在 user 根下）	否（trust: system，只读）
适用场景	无法改 profile 配置的环境；交付一个"带走即用"的目录	自己的机器/团队 profile；长期使用并跟随升级

渠道 A（复制）：仓库的 preset/molbio-lab/ 即完整预设目录，复制过去即可：

~/.dsh/.agent-presets/molbio-lab/
├── agent.cordis.yml                 # 标准编码 Agent + 末尾的 tool-molbio 行
├── preset.yml                       # 显示名称与描述
└── plugins/
    └── dsh-molbio-tools-v16/        # 插件文件（版本目录，见下文）

对方重启（或刷新预设列表）后，在预设选择器中选择 Molecular Biology Lab 新建会话。 代价是每个新版本都要把目录重新复制到新的 vN（复制的那份会冻结在旧版本）。

渠道 B（注册，新）：前提是该 profile 本来就装了本包（dsh plugin add 会把 46 个工具 装进该 profile，但不会让 preset 出现在选择器里）：

dsh plugin --profile web add dsh-molbio-tools    # 1. 装包（工具 + bundle 层）
node \preset\install.mjs --profile web   # 2. 注册包内 preset（幂等）

脚本只改 profile 的 cordis.patch.yml：追加一条 - id: agent-presets 补丁，把 /preset 加进 config.roots（trust: system）。三个特性：

• 幂等：重复运行零字节改动；--check 可当健康检查（未注册时退出码 1），--dry-run 只打印不落盘；
• 先备份后写：cordis.patch.yml.bak-；
• 写完自检：跑 dsh --profile --dump-config，确认组合树确实带上了新 root。

之后重启该 profile，选择器里就会出现 Molecular Biology Lab；以后升级只跑 dsh plugin --profile update dsh-molbio-tools —— root 路径跨版本恒定，所以不用重新复制、 也不用再动配置。两条渠道共存时，重复 id 由配置根（渠道 B）胜出。

机制细节、升级 Runbook、完整取舍表与已知限制见 docs/route-b.md。

兼容性：当前 preset 组合已对齐 DSH 0.1.5-alpha.2（persona 行的 prefix/suffix 契约、present 行）。DSH 侧插件包改名或改配置契约时，preset 会 硬挂载失败（该模式直接从选择器里消失），而插件代码本身仍然是好的——用 node test/preset-health.mjs 可以把每一行的 config 交给对应包自己的 schema 复核， 一眼看出是哪一行、哪个字段坏了。

插件更新（版本目录规则）

DSH 的 standing 挂载按 ESM 模块 URL 缓存模块。每次更新必须新建版本目录 （如 dsh-molbio-tools-v16/）并同步修改 agent.cordis.yml 中的插件行；绝不在已发布 目录里原地改文件。分发者从包根目录把 .mjs 文件复制进新版本目录即可：

cp *.mjs preset/molbio-lab/plugins/dsh-molbio-tools-v16/
# 并把 agent.cordis.yml 的行改为 './plugins/dsh-molbio-tools-v16/index.mjs'

安装（可选：官方组合包 bundle，全局可见）

本包同时是官方的组合包（bundle）（dsh.bundle manifest → cordis.patch.yml）。 注意：bundle 把插件行注册到 profile 的全局 tools 层——该 profile 的所有会话都会 加载 molbio 工具与提示段。适合"整个 profile 专用于分子生物学"的用户，不适合混合用途。

方式	命令	用户安装
GitHub	推送到仓库	dsh plugin --profile add github:lovy2004/dsh-molbio-tools（纯 JS 零构建，无需 prepare 脚本与构建授权）
npm 发布	npm publish	dsh plugin --profile add dsh-molbio-tools
tarball	pnpm pack	dsh plugin --profile add ./dsh-molbio-tools-0.1.0.tgz

验证方式（官方推荐）：

dsh plugin --profile demo add       # 需要用户机器装有 pnpm（官方流程依赖）
dsh --profile demo --dump-config        # 组合树中应出现 "# == dsh-molbio-tools" 层

本仓库已验证：--dump-config 输出以 # == dsh-molbio-tools + - id: tool-molbio / name: dsh-molbio-tools 开头（层序在 dsh-base 之上），且从 profile 目录按包名 import('dsh-molbio-tools') 成功注册全部 46 个工具。两种安装方式可以共存（同名工具 由 preset 层 shadow 全局层，无冲突），但通常二选一即可。

版本目录规则的原理（维护者必读）：DSH 的 standing preset 挂载在整个进程生命周期 内存在，且 Node 的 ESM 模块缓存以文件 URL 为键——同一 URL 的 import() 永远返回 第一次加载的模块，包括插件内部的相互 import（给入口加查询串只能破坏入口自身的 缓存，依赖文件仍会命中旧缓存）。因此原地替换 .mjs 不会让新会话加载新代码；目录名 变化使所有模块 URL 一次性更新。旧目录可删除（已运行的 generation 持有内存中的模块， 不受磁盘删除影响）。

行为与假设

• 纯计算工具（序列/引物/统计）确定性、无副作用；输入输出均为可持久化的 JSON。
• 图谱工具直接写文件：molbio_plasmid_map / molbio_plasmid_map_file 把 SVG 写入工作区（ctx.fs + 会话沙箱政策），模型上下文里只出现文件路径，避免大文本截断。
• 自动查看（auto-view）：所有生成图片的工具（molbio_plasmid_map、molbio_plasmid_map_file、molbio_clone_simulate/molbio_golden_gate 的 map_path、molbio_qpcr_efficiency 的 plot_path、molbio_plot、molbio_virtual_gel）写完 SVG 后自动用操作系统默认应用打开（Windows 为 Invoke-Item、macOS 为 open、桌面 Linux 为 xdg-open/$BROWSER、WSL 自动转译为 Windows 路径），结果中的 auto_viewed 字段报告交接是否成功。每调用可用 auto_view: false 关闭；无桌面环境（headless Linux）与 MOLBIO_AUTO_VIEW=0 时自动跳过。
• 克隆模拟约定：酶切-连接要求"插入片段按 5'→3' 书写、上游酶在 5' 端"；单酶连接会给出双向连接说明与两种方向的验证酶切；特征坐标按插入/缺失自动平移，跨越连接点的特征标注 spans_insertion。
• Sanger 验证：参考序列按环状处理（读段跨 origin 也能正确对齐）；.ab1 低质量（ 0时，若某窗口没有精确引物通过全部约束，设计器用**最少的替换**尝试挽救（只针对可修复的约束：GC 失衡、run、Tm 微差）。3' 末端碱基永远不错配，默认在 3' 端mismatch_3prime_zone（默认 5 bp）关键区内也不放错配（max_3prime_mismatches` 可放宽）。每处错配逐条报告：引物内位置、模板位置、模板碱基/引物碱基、距 3' 端距离；每个错配都会加重排序罚分——存在精确引物时精确引物永远优先。
• Primer3 对齐的结构筛查（v12）：自互补（self-any/self-end）为比对分（match +1 / mismatch −1 / gap −0.25，阈值 8.0/3.0）；发夹与引物二聚体（any/end）用与 Tm 相同的 SantaLucia NN 参数折成 Tm（默认阈值 47 °C